Xác định nồng độ protein

XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ PROTEIN
1. Xác định nồng độ protein hoà tan theo Lowry
a. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước song 660nm.
Cường độ mầu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
b. Hoá chất cần dùng 
- Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20g Na2CO3 (2%) pha trong 1000ml nước cất.
- Dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H2O (0,5%) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1%) hoặc trong dung dịch Natri, Kali Tactơrat 1%.
- Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước khi dùng).
- Thuốc thử folin, trước khi dùng pha loãng hai lần sao cho độ axit bằng 1N.
- Albumin huyết thanh bò 1mg/ml.
c. Cách tiến hành
- Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dịch chứa protein với hàm lượng thích hợp cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 10 phút. Sau đó thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25ml folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 30 phút, mầu vàng của hỗn hợp chuyển sang mầu xanh da trời và đạt đến cường độ mầu cực đại. Đem so mầu của hỗn hợp trên máy so mầu quang điện ở bước sóng 660nm. Xác định được trị số mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu. Đo trên máy 3 lần lặp lại và lấy trị số trung bình.
- Mẫu đối chứng: 0,5ml đệm cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm.
d. Xây dựng đường đồ thị chuẩn
Hàm lượng protein tan trong dung dịch được xác định theo phương pháp Lowry, dùng albumin huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn.
Cân 0,01g (10mg – albumin huyết thanh bò) hoà tan trong 10ml nước, ta được dung dịch gốc có nồng độ là 1mg/ml. Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất với các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100, 120 g/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn.
- Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dung dịch BSA ở nồng độ pha loãng như trên cho vào ống nghiệm, thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch C để ở nhiệt độ phòng 10 phút, sau đó cho 0,25ml thuốc thử folin (1N) đem so mầu với bước sóng 660nm.
- Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và các bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm.
Qua 3 lần lặp lại thí nghiệm có thể xây dựng đường hồi quy. Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường. 
Ta có phương pháp hồi quy.
y = 0,55066844x + 0,01791961
 660
nm
OD
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0
mg
 Hàm lượng protein
Hình 1. Đường đồ thị xác định nồng độ Protein theo phương pháp Lowry
Dựa vào đồ thị chuẩn, có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
2. Xác định nồng độ protein theo Bradford
Hàm lượng protein huyết thanh có thể được định lượng theo phương pháp Bradford (1976).
a. Vật liệu và dụng cụ
- Các mẫu protein.
- Dung dịch mầu:
+ Coomassie blue G (serva No 35050) 40mg
+ Ethanol (EtOH) (absolute) 20ml
+ H3PO4 85% 40ml
+ H2O 40ml
- Dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin) 100mg/ml.
- Cóng đo bằng nhựa.
- Pipet man (Hãng Gilson – Pháp).
- Máy đo quang phổ Shimadzu UV – 200s (Japan).
b. Cách tiến hành
- Xây dựng đường cong chuẩn biểu diễn nồng độ protein chuẩn (BSA): 1,8ml dung dịch protein chuẩn có chứa từ 5 – 40mg BSA trong nước cất được đưa vào cóng đo nhựa.
Thêm 0,6 ml dung dịch mầu, lắc đều để 5 phút cho phản ứng xẩy ra ở nhiệt độ phòng.
Đo độ hấp phụ ở bước sóng 595 nm sau 2 phút.
Dung dịch mẫu trắng (Blank) được chuẩn bị từ 1,8ml nước cất và 0,6 ml chất thử mầu.
Dựng đồ thị biểu diễn hàm lượng BSA tương ứng với giá trị OD 595nm. Đường cong tiêu chuẩn này được sử dụng để xác định hàm lượng protein trong các mẫu chưa biết, cũng được xây dựng tương tự theo phương pháp Lowry.
- Định lượng protein của mẫu.
Các mẫu có chứa từ 1 – 10 mg protein trong 1,8 ml H2O được đưa vào cóng nhựa.
Thêm vào 0,6ml dung dịch mầu lắc đều.
Đo độ hấp phụ quang học (OD) ở bước sóng 595nm.
Dựa vào đồ thị chuẩn xác định hàm lượng protein trong mẫu theo công thức sau:
 X(mg) = 
Trong đó: 
+ X: số mg protein có trong mẫu
+ [C]: nồng độ protein theo đồ thị 1000 (mg/ml).
+ V: thể tích dung dịch mẫu.
+ a: độ pha loãng dung dịch.
3. Xác định nồng độ protein bằng phương pháp quang phổ
- Nguyên tắc của phương pháp này là các axit amin acid thơm như trytophan, tyrosine và phenylalanine trong chuỗi pholypeptit có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 280nm.
- Sử dụng BSA làm chất chuẩn, biết rằng ở bước sóng 280nm 1ml BSA có nồng độ 1mg/ml sẽ có mật độ quang học là OD = 0,67. Dựa vào đó có thể xác định hàm lượng protein trong các mẫu thí nghiệm theo công thức sau:
 Y(mg) = 
Trong đó:
+ [OD]: mật độ quang học của 1ml dung dịch mầu.
+ V: thể tích dung dịch mầu.
+ a: độ pha loãng dung dịch
Chú ý: 
1. Con số 0,67 là hệ số tắt của BSA. Để xác định nồng độ các loại protein khác thì cần phải sử dụng hệ số tắt tương ứng đối với mỗi loại protein. Ví dụ: hệ số tắt của protein con A là 1, 2.
2. Lựa chọn các protein tiêu chuẩn cần có cấu trúc tương tự như cấu trúc của các protein cần đo xét nghiệm ở mẫu nghiên cứu vì các protein thường có hệ số tắt khác nhau ở bước sóng 280nm (Hệ số tắt biểu thị bằng sự hấp thụ của dung dịch 1% protein đối với một tia sáng có bề dày 1cm). Thêm vào đó, các protein có cấu trúc khác nhau cũng cho khả năng tạo phản ứng mầu khác nhau với các thuốc thử tạo mầu như thuốc thử folin – ciocalteu, coomassie brilliant blue G 250.
Sau đây là bảng cho các giá trị hệ số tắt (, nghĩa là sự hấp thụ của dung dịch 10mg protein/ml ở bước sóng 280nm) đối với một số loại protein khác nhau:
Bảng 3.1. Hệ số tắt của một số protein ở bước sóng 280nm
 (theo Fashman, 1976)
Các protein
IgG
13,6
IgM
11,8
IgA
13,2
IgA tiết
13,1
IgD
17,0
IgE
15,3
Chuỗi 
13,7
Chuỗi 
13,9
Chuỗi 
15,5
Chuỗi nhẹ
12,3
Fab
15,0
Fc
12,0
VH
27,0
Con A (lectin Canavalia ensiformis)
12,0
Lectin Lens culinaris (LCA)
12,5
BSA
6,7
3. Nếu chưa biết hệ số tắt của protein, hoặc dung dịch gồm hỗn hợp của một số dạng protein thì nồng độ protein tổng số có thể được tính theo phương trình sau:
Nồng độ protein, tính theo mg/ml = 1,55 x A280 – 0,77 x A260
Trong đó:
+ A280 là giá trị hấp thụ ở bước sóng 280 nm.
+ A260 là giá trị hấp thụ ở bước sóng 260 nm.
4. Nếu tỉ lệ A280/A260 thấp hơn 0,6 nghĩa là dung dịch protein đã lẫn (nhiễm) axit nucleic, các peptit, chất tẩy rửa hoặc chất kháng khuẩn azit natri (NaN3). Trường hợp này cần sử dụng phép đo nồng độ protein theo kỹ thuật Lowry hoặc Bradford.
5. Dung dịch protein có nồng độ thấp hơn 0,1mg/ml thường cho kết quả không chính xác.