Một số phương pháp phân tích Hóa Sinh

Một số phương pháp phân tích hóa sinh
1. Phương pháp đo Quang
(Đo màu định lượng)
 	Đo quang là một phương pháp phân tích định lượng dựa trên cường độ màu của bản thân chất cần định lượng hoặc được tạo ra bằng các phương pháp thích hợp
1.1. Cơ sở của phương pháp: Định luật Lambert-Beer
1.1.1. Cơ sở:
 Khi chiếu một tia sáng đơn sắc có cường độ I0 qua một dung dịch màu có chiều dày l, thì một phần ánh sáng bị phản xạ (IP), một phần bị hấp thụ bởi dung dịch màu (IH), phần còn lại ló ra ngoài (It).
 ----- l-----
 I0	It
	IH
 IP
Hình 1: Sự phân bố của tia sáng đơn sắc khi chiếu qua một dung dịch
Như vậy: I0 = IP + IH + It (1)
Trong các dung dịch màu nước thường gặp trong phân tích đo màu thì IP rất nhỏ, có thể bỏ qua. 
Do đó : I0 = IH + It (2)
Từ đó, thấy rằng :
 - It chính là phần ánh sáng không bị hấp thụ, đi qua dung dịch, đập vào mắt ta, gây ra cảm giác về màu của dung dịch. 
 - Vì I0 không đổi, nên khi IH càng lớn thì It càng nhỏ. IH càng lớn nếu trên đường đi ánh sáng gặp nhiều phân tử chất màu hay là khi nồng độ chất màu càng lớn và chiều dày dung dịch càng lớn. Và ngược lại, khi IH càng nhỏ thì It càng lớn.
 Thiết lập mối quan hệ giữa I0 , IH , It là nội dung cơ bản của định luật hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu.
1.2 Các định luật về sự hấp thụ ánh sáng
1.2.1. Định luật Lambert / Bouger
Cường đọ của một chùm tia sáng đơn sắc khi đi qua một dung dịch chất hấp thụ tỷ lệ nghịch với chiều dày của lớp dung dịch mà nó đi qua.
It = I0. 10- kl
Trong đó:	I0 là cường độ chùm sáng tới
	It là cường độ chùm sáng đã truyền qua môI trường.
	K là hệ số hấp thụ 
	L Chiều dày môI trường hấp thụ
1.2.2 Định luật Beer:
Sự giảm cường độ ánh sáng khi đi qua một dung dịch chất hấp thụ phụ thuộc vào số lượng các tiểu phần chất hấp thụ mà ánh sáng gặp phải trên đường đị của chùm sáng, nghĩa là phụ thuộc vào nồng độ C của dung dịch chất hấp thụ:
K = aC
	a là hằng số hấp thu, C là nồng độ dung dịch
1.2.3 Định luật lamber - Beer: Kết hợp hai phương trình trên ta có
It = I0. 10- aCl
 - Độ truyền quang T : 
T = It / I0 = 10- aCl
	- Độ hấp thu quang A ( Mật độ quang OD)
	A = OD = lg1/T = lg1/10- aCl = aCl 
Với l chiều dày cuvet đo là 1 cm, a là hằng số thì OD tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch.
Đây là hệ quả quan trọng của định luật Lambert-Beer để hiểu phương pháp đo màu định lượng: khi nồng độ chất màu càng lớn thì mật độ quang học đo được càng lớn và ngược lại.
1.3. Các yếu tố ảnh hởng đến màu của dung dịch và làm sai lệch định luật Lambert-Beer 
 + Phơng pháp đo màu thường được tiến hành nh sau :
- Cho chất thử X cần định lượng có trong dung dịch kết hợp với thuốc thử R để tạo thành phức hợp RX có màu :
 X + R XR 
 (không màu) (không màu) (có màu)
 - Đo mật độ quang học (E) của dung dịch, xác định nồng độ XR và suy ra nồng độ của X.
 Do mật độ quang học E chỉ tỷ lệ thuận với nồng độ XR, nên phải chuyển được toàn bộ X thành XR và màu của XR phải bền vững, không bị pha tạp bởi màu của các chất khác.
 + Những điểm cơ bản cần chú ý:
 - Thuốc thử R:
 Đối với mỗi một chất cần định lượng X, phải chọn đợc thuốc thử R thích hợp để phức hợp XR tạo thành có màu bền vững, ít phân ly.
 Trong phần lớn trường hợp, phức hợp XR chỉ được tạo thành sau một khoảng thời gian (quá trình sinh màu), đạt cực đại rồi giảm dần (quá trình phai màu). Sự đo màu chỉ chính xác và nhạy nhất khi đo trong khoảng thời gian cường độ màu đạt cực đại và ổn định nhất. Do đo, cần xác định trớc khoảng thời gian này. 
 - Pha loãng dung dịch phức hợp màu:
 Do phản ứng tạo thành và phân ly của XR là một quá trình thuận nghịch và cường độ màu của dung dịch phụ thuộc vào tỷ số nồng độ giữa các dạng có màu và không màu, nên khi pha loãng (hay làm giàu) dung dịch sẽ làm sai lệch định luật Lambert-Beer. Vì vậy, khi cường độ màu của dung dịch vợt quá giới hạn đo thì phải pha loãng mẫu thử và làm lại xét nghiệm. 
 Có thể hạn chế ảnh hởng này bằng cách dùng chính thuốc thử R khi pha loãng dung dịch màu (chứ không dùng nước cất) để hạn chế sự tăng độ phân ly của XR. 
 - pH của dung dịch 
 Sự thay đổi pH (tăng hay giảm nồng độ H+) của dung dịch làm thay đổi màu của dung dịch. Do :
 . pH ảnh hởng đến sự tạo thành phức hợp XR và do đó làm thay đổi màu. 
Ví dụ, ở pH=1,8–2,5, ion Fe3+ kết hợp với sulfosalicylat tạo thành ion phức monosulfosalicylat [Fe(Sal)]2+ có màu đỏ; còn ở pH=8-11, ion Fe3+ kết hợp với sulfosalicylat tạo thành ion phức sulfosalixylat [Fe(Sal)3]2+ có màu vàng.
 . pH ảnh hởng đến sự phân ly và phân huỷ phức hợp màu.
 . H+ trực tiếp tham gia vào phản ứng dẫn đến làm đổi màu của dung dịch. Ví dụ, trong phản ứng:
2 CrO42 - + 2 H+ CrO2 - + H2O
 (vàng) (da cam)
 Do đó, người ta phải nghiên cứu trớc các dung dịch màu chuẩn để tìm ra khoảng pH thích hợp.
 - ảnh hởng của ion lạ:
 Ion lạ có thể có màu riêng, có thể kết hợp với R thành một phức hợp có màu làm ảnh hởng đến màu của phức hợp XR, có thể tạo với R một phức hợp không màu làm hao hụt thuốc thử R gây giảm sự tạo thành phức hợp XR.
 Để loại bỏ ảnh hởng này, có thể : 
 . Dùng một lượng R vừa đủ để tạo thành phức hợp XR nếu XR bền hơn phức hợp của R với ion lạ hoặc cho thừa nhiều R nếu XR kém bền hơn phức hợp của R với ion lạ.
 . Dùng một hợp chất khác để tạo với ion lạ một phức hợp bền vững, gọi là “khóa ion lạ”.
 . Thêm vào dung dịch chuẩn một lợng ion lạ bằng lợng ion lạ có trong dung dịch cần định lợng.
 . Tách riêng ion lạ bằng các phơng pháp thích hợp trớc khi định lượng X.
 . Đo màu ở bớc sóng đặc hiệu của XR.
 Do tất cả những yếu tố trên, nên trong phân tích so màu phải tuân thủ chặt chẽ thành phần và liều lợng thuốc thử, pH của dung dịch, thời gian đo màu, bớc sóng của ánh sáng tới, dung dịch đối chiếu...
1.2. Máy đo quang 
 Có nhiều loại máy đo quang: quang kế (Photometer), quang phổ kế (Spectrophotometer)... với các bước sóng cố định (dùng kính lọc) hoặc có thể thay đổi (dùng cách tử)... Nói chung, cấu tạo của các máy đo quang đều gồm các bộ phận chính sau:
 - Nguồn sáng: dùng đèn thường, đèn thuỷ ngân, đèn halogen, đèn cực tím 
 - Bộ phận tạo ánh sáng đơn sắc: kính lọc hoặc cách tử
 - Cóng đo (cuvette): có chiều dày (l) không đổi (0,5 cm, 1 cm); bằng thạch anh, thuỷ tinh, nhựa.
 -Tế bào quang điện: để biến đổi quang (ánh sáng ló) thành dòng điện.
 - Bộ phận khuếch đại.
 - Bộ phận đo và hiện kết quả: thang đo hoặc màn hình hiện số.
Sơ đồ cấu tạo đơn giản của các máy đo quang như sau:
 1 2 3 4 5 6
 Nguồn sáng Kính lọc Cóng đo Tế bào Khuếch đại Hiện kết 
(Đèn) hoặc cách tử quang điện quả
Hình 2: Sơ đồ cấu tạo đơn giản của máy đo quang
 Ngoài các bộ phận chính trên, các máy còn có thể có thêm các phần khác nh các bộ phận điều chỉnh, các bộ phận gá lắp thêm...
1.3. Các phương pháp Đo màu.
1.3.1. Đo màu bằng mắt :
 Dùng khi không có máy đo quang hoặc khi chỉ cần đánh giá tương đối .
1.3.1.1. Phương pháp dùng thang mẫu ( hoặc gam màu)
 - Điều chế một dãy ống dung dịch chuẩn (ống chuẩn) có nồng độ tăng dần đã biết (CS) đựng trong các ống nghiệm đồng chất.
 - Điều chế một ống dung dịch thử (ống thử) có nồng độ cha biết (CT) theo các điều kiện giống hệt như khi điều chế các dung dịch chuẩn và đựng trong ống nghiệm đồng chất với các ống nghiệm của dung dịch chuẩn. 
 - So màu của ống thử với các ống chuẩn để tìm ống chuẩn có cường độ màu bằng cường độ màu của ống thử. 
 Nồng độ của ống chuẩn chính là nồng độ của ống thử .
 Tuỳ theo từng dung dịch mà người ta có các cách quan sát cường độ màu khác nhau.
1.3.2. So màu bằng máy 
1.3.2.1. Phương pháp so sánh (hay phơng pháp dùng ống chuẩn ) 
 - Điều chế song song một dung dịch chuẩn chứa chất cần xác định có nồng độ đã biết (CS) và một dung dịch thử chứa chất cần xác định có nồng độ chưa biết (CT) theo cùng một qui trình.
 - Đo mật độ quang học (E) của ống chuẩn và ống thử trong cùng điều kiện (máy, bớc sóng, cóng ...), được ES và ET tương ứng. 
 - Tính kết quả theo công thức: 
 ET
 CT = x CS
 ES
1.3.2.2. Phương pháp biểu đồ mẫu :
- Điều chế một dãy dung dịch chuẩn chứa chất cần định lượng có nồng độ đã biết (CS) tăng dần .
 - Đo mật độ quang học (E) của từng ống, được các ES tương ứng .
	 - Biểu diễn sự phụ thuộc của ES theo CS trên trục toạ độ, được một đường thẳng
 ES
 ET
 CT CS
 Hình 3: Phương pháp xác định nồng độ một dung dịch bằng biểu đồ mẫu
 - Điều chế một ống thử chứa chất cần định lượng có nồng độ chưa biết CT theo cùng một qui trình như đối với ống chuẩn. 
 - Đo mật độ quang học của dung dịch thử, đợưc ET .
 - Từ đồ thị tính được nồng độ CT 
 Chú ý : . ET phải nằm trong khoảng của các ES 
 . Biểu đồ mẫu phải dựng hàng ngày .
1.3.2.3. Phương pháp hệ số
 - Điều chế một dãy ống chuẩn có nồng độ CS đã biết và tăng dần.
 - Đo mật độ quang của các ống chuẩn được các ES tương ứng.
 - Tính hệ số a (hoặc F) theo công thức
 ồ CS
 F = 
 ồ ES
 - Điều chế một ống thử có nồng độ chưa biết (CT).
 - Đo mật độ quang của ống thử, được ET.
 - Tính nồng độ ống thử (CT) theo công thức:
CT = F. ET
 Chú thích :
 Trong dung dịch màu có các hợp chất khác (có trong thuốc thử để tạo hợp chất màu) khi đo màu cũng cho một mật độ quang học nhất định. Vì vậy, khi định lượng bằng đo màu, ngời ta thờng đối chiếu ống thử và ống chuẩn với một ống trắng để loại trừ ảnh hưởng này, khi đó E đo được là do chất màu cần định lượng gây ra.
1.4 Các phương pháp đo trên máy bán tự động
1.4.1 Phương pháp đo điểm cuối
1.4.2 Phương pháp đo hai điểm
1.4.3 Phương pháp đo động học
Các loại ống trắng :
Có 3 loại : Trắng thuốc thử, Trắng bệnh phẩm, Trắng nước cất hoạc không khí